采用NK细胞定制病毒载体大幅提升CAR-NK细胞的杀伤肿瘤能力

作者：郭长江      时间：2023-03-10

在国家重点研发计划（批准号:2019YFA0906000）和国家自然科学基金项目（批准号：82003261）等资助下，本研究团队在自然杀伤（NK）细胞慢病毒载体优化改造研究领域取得进展。研究成果以“使用优化的慢病毒载体增强CAR在人NK细胞中的表达和细胞毒性（Engagement of an optimized lentiviral vector enhances the expression and cytotoxicity of CAR in human NK cells）”为题，于2023年03月01日发表于《分子免疫学》(Molecular Immunology)。本研究论文通过对经典的慢病毒载体pCDH进行结构优化，成功制备出嵌合抗原受体(CAR)表达水平显著提高的CAR修饰自然杀伤细胞(CAR-NK细胞)，并表现出大幅增强的杀伤肿瘤细胞的体外活性。这一研究为提升CAR-NK细胞在肿瘤免疫治疗中的疗效提供了新的思路。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.molimm.2023.01.010。

【研究背景】

癌症是一种严重的疾病，在全球范围内影响着数百万人。传统的化疗和放疗等传统治疗对身体存在较大的副作用，且效果通常有限。近年来，一种称为嵌合抗原受体(CAR)修饰的T或NK细胞(CAR-T/NK)的新型癌症治疗方法应运而生。CAR-NK细胞是一种通过基因工程使NK细胞表面表达CAR而获得特异识别并杀伤肿瘤细胞的能力的细胞工程产品。研究者通常用含有CAR基因的慢病毒载体感染NK细胞来制备CAR-NK细胞。但目前大多数CAR-NK细胞表面CAR的阳性表达率不到50%。因此，CAR-NK细胞治疗的有效性受到CAR低表达的限制，远不能满足临床需要。为了解决这一问题，研究团队一直在探索改善CAR-NK细胞转染和制备质量的方法。

【研究内容】

我们发现采用双启动子的慢病毒载体pCDH制备CAR-NK细胞中CAR表达较低，且经抗性筛选可提高报告基因的表达而CAR的表达水平仍然很低。为提高CAR的表达水平，我们将pCDH载体的第二启动子EF1替换为自切割肽P2A序列，获得优化后的单启动子载体pCDHsp。结果证实pCDHsp可在转导NK细胞后使CAR与GFP的表达高度一致并协同提升。筛选后，pCDHsp-CAR-NK细胞的CAR表达水平比原pCDH载体的提高了200多倍，并表现出显著增强的针对胃癌细胞SGC-7901的杀伤活性。

图1. 原始pCDH慢病毒载体（A）的示意图，优化后的pCDH慢病毒载体（B）以及基于NKG2D的嵌合抗原受体（C）的示意图。

图2. NK92细胞通过转染不同pCDH慢病毒载体后GFP和CAR的表达，通过流式细胞术评估。（A）在抗性筛选期间，转染pCDHdp-CAR和pCDHsp-CAR的NK92细胞中GFP和CAR的流式细胞术分析。（B-C）在抗性筛选期间，转染的NK92细胞中GFP（B）和CAR（C）的平均荧光强度（MFI）。Day0，抗性选择开始前的一天。Day7/Day14，抗性选择开始后的第7天和第14天。

图3. 稳定转染的NK92细胞中CAR介导的细胞毒活性。 （A）通过流式细胞术评估人胃癌细胞株KATO-III和SGC-7901中NKG2D配体（NKG2DLs）的表面表达。（B）细胞毒性实验测量不同工程化修饰NK92细胞对两种靶细胞的杀伤活性。（C）未转染和转染的NK92细胞对SGC-7901细胞的细胞毒作用的显微观察。壁附癌细胞由黄色箭头标示。

【研究意义】

该研究表明，优化后的单启动子慢病毒载体pCDHsp可有效提升CAR在NK细胞中的表达水平，可作为NK定制化（NK-tailored）载体使用。使用该载体和相应制备方法可提供了质量更优更均一的CAR-NK细胞，从而大幅提高了CAR-NK细胞的肿瘤杀伤活性。这一策略将有助于CAR-NK细胞疗法转化到临床，为肿瘤患者带来新的希望。

（文/郭长江 图/郭长江）